EKTRASI DNA

LAPORAN PRAKTIKUM

GENETIKA

OLEH

ARIF GUNAWAN

D1A012006

LABORATORIUM PEMULIAN TANAMAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS JAMBI

JANUARI 2015

EKTRASI DNA

Tujuan
            Mahasiswa dapat melakukan ekstraksi DNA beberapa jenis tanaman

Prinsip Teori
            Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008).
           Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian  dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007).
            Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut dalam nucleus dan sitoplasma ( Elrod, 2007 ).
           Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma, termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA pada tanaman dan hewan untuk mengetahui dan mempelajari DNA dari tanaman dan hewan tersebut. Sel eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan komponen-komponen lain. DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Albert, 1994).
          DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012).
        Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Kirsman, 2010).
        Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Kirsman, 2010).

            Prinsip – prinsip dalam mengisolasi DNA (Tohib, 2012) :

1. melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.
2. pemecahan dinding sel.
3. pemecahan membran sel.
4. pemisahan DNA dari bahan yang lain.

            Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara mekanik atau fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita gunakan dengan mortar atau blender. Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA) bisa keluar (Tohib, 2012). 

Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan (Tohib, 2012).
           CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel (Tohib, 2012).
          Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE triselectrophoresisberfungsi untuk melarutkan DNA yangdihasilkan dan menjagaDNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA atau Ethylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease. Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Asris, 2010).
          Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yangdiproleh lebih tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan kit. Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi CTAB adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara maupun lama waktu penyimpanan (Asris, 2010).

Bahan dan Alat

Bahan dan alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah blender, gelas piala, gelas ukur, saringan, tabung reaksi, daun manggis, daun bayam, daun terong, daun cabe, bawang Bombay, garam, deterjen cair, alcohol, dan air.

Langkah Kerja

1.      Siapakan bahan yang akan diblender, jika pertulangan daun keras maka pertulangan daun dipisahkan dan lembar daun di potong kecil-kecil. Begitu juga dengan bawang Bombay yang diiris kecil-kecil

2.      Blender bahan dengan air secukupnya dan garam 1/8 sendok teh agar mendapatkan patinya. Jalankan blender kurang lebih selama 15 detik dengan kecepatan tinggi. Untuk setiap bahan (daun manggis, daun bayam dan bawang Bombay) diblendar dengan terpisah-pisah

3.      Setelah selesai campuran disaring sebanyak dua kali, untuk memisahkan antara ampas dan cairannya agar mendapatkan cairan yang murni. Dan cairan tersebut dimasukkan kedalam gelas piala. Lalu ditambahkan deterjen cair sekitar 2 sendok makan dan gelas piala digoyang-goyang dengan perlahan hingga tercampur merata dan diamkan selama 10-15 menit

4.      Cairan tersebut dimasukkan kedalam tabung reaksi 1/3 bagian

5.      Miringkan tabung reaksi dan memasukkan cairan alcohol dengan perlahan-lahan melalui dinding rabung reaksi hingga terlihat lapisan lendir diantara cairan alcohol dan air

6.      Perhatikan bagian tersebut karena bagian tersebut adala DNA.

Hasil dan Pembahasan
         Hasil
Dari praktikum yang dilakukan maka didapatkan hasil sebagai berikut :

Penyaringan ekstrak daun bayam             Penambahan alkohol pada ektrasi daun bayam

  

Penyaringan ekstrak daun manggis             Daun cabe              Bawang bombay

      

Daun Terong           Daun bayam                Daun Manggis

      

Pembahasan
            Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Pada praktikum isolasi DNA, dilakukan isolasi terhadap beberapa jenis  tanaman seperti manggis, bayam, cabe, terong dan bawang bombai.Isolasi DNA ini dilakukan melalui beberapa tahap, Tahap pertama yang dilakukan yaitu penghancuran dengan menggunakan blender atau alat penghalus lain nya seperti di giling beberapa daun tanaman dan bahan yang digunkan yaitu air dingin dan garam, dengan menggunakan blender.

Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti. Pengisolasian DNA menggunakan garam dapur dengan tujuan untuk memekatkan DNA.

Hal ini dapat terjadi karena ion Na⁺ yang dikandung oleh garam mampu membentuk ikatan dengan kutub negative pada ikatan fosfat DNA. Saat ion Na⁺ garam berikatan dengan fosfat, pada saat itulah DNA akan berkumpul. Selanjutnya, Penyaringan atau filtrasi dilakukan untuk mengumpulkan cairan kaya DNA dan memisahkannya dari sisa-sisa bagian jaringan (sel) lain yang tidak diperlukan, dan    Hasil saringan diharapkan banyak mengandung DNA yang akan diuji.

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa ”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia

Penambahan alcohol pada permukaan larutan betujuan untuk melakukan presipitasi sehingga DNA yang telah terkumpul tadi mampu memisah dari larutan dan terbentuklah lapisan-lapisan yang dapat diidentifikasi unsur penyusunnya.

            Berdasarkan analisis data yang kami peroleh terdapat tiga lapisan. Lapisan terbawah adalah filtrat, lapisan tengah berupa gumpalan-gumpalan seperti ‘jely” yang merupakan DNA, sedangkan lapisan teratas adalah alkohol yang berwarna bening. Dilihat dari sumber DNA yang digunakan untuk pengisolasian ini, jenis daun yang digunakan pada dasarnya tidak menunjukkan perbedaan yang nyata.

            Masing-masing daun yakni terong, dan bayam, cabai dan, bawang bombai untuk sumber DNA menghasilkan DNA yang berbentuk gumpalan-gumpalan seperti ‘jely” berwarna putih. Namun dalam percobaan pada daun manggis tidak ditemukan gumpalan berupa jelly ini karena pada daun manggis menggandung tannin atau lapisan kayu yang menghambat pemecahan dinding sel pada saat pengaplikasian, sedangkan pada daun yang lainnya karena teksturnya yang agak lembut jadi penghancuran dan pemisahan DNA dan dinding sel mudah dilakukan kali ini yang DNA berhasil dilihat adalah dari daun bayam dan daun cabe DNA yang terlihat sudah lumayan namun masih sedikit tercampur subtrat sehingga warnanya tidak putih bersih.

Kesimpulan dan Saran
            Dari praktikum yang dilakukan dapat diambil kesimpulan bahwa

·         DNA yang didapatkan dari daun bayam dan cabe berupa gumpalan putih meski dalam percobaan ini tidak terlalu putih bersih karena masih terdapat zat-zat lain.

·         Pada daun manggis tidak ditemukan gumpalan berupa jelly ini karena pada daun manggis menggandung tannin atau lapisan kayu yang menghambat pemecahan dinding sel pada saat penghancuran

·         Dalam ekstraksi DNA dapat menggunakan garam berperan sebagai ”lysing buffer”, yakni menjaga pH larutan agar tetap konstan, sehingga diharapkan tidak terjadi denaturasi DNA.

·         Deterjen berperan Merusak membran sel dan membran inti sehingga DNA yang diinginkan dapat dikeluarkan dari dalam sel, dan alkohol untuk memisahkan ekstraksi, dan DNA.

5.2.    Saran

          Pada saat praktikum, sebaiknya langkah-langkah kegiatan praktikum dilakukan dengan sesuai dan sangat hati-hati karena kesalahan yang terjadi dapat mengakibatkan pengaruh yang kurang baik terhadap hasil. Hal ini terutama dalam penggunaan bahan harus sesuai dengan aturan yang telah ditentukan dalam petunjuk kegiatan praktikum.